Ventajas

La transcriptasa inversa EntiLink™ presenta una estabilidad térmica notablemente mejorada y puede soportar temperaturas de reacción de hasta 50 °C, lo que la hace adecuada para la transcripción inversa de moldes de ARN con estructuras secundarias complejas. Además, presenta una mayor afinidad por los moldes y es adecuada para la transcripción inversa de pequeñas cantidades de moldes y genes con bajo número de copias. Además, la transcriptasa inversa EntiLink™ tiene una capacidad mejorada para sintetizar ADNc de longitud completa, que puede amplificarse hasta 10 kb.

Introducción:

El kit contiene todos los componentes necesarios para sintetizar ADNc de primera cadena de alta calidad a partir de ARN total o ARNm, e incluye dos cebadores para la síntesis de ADNc: los cebadores aleatorios N6 y oligo (dT)18. El ADNc monocatenario sintetizado puede utilizarse directamente en posteriores reacciones de PCR o qPCR.

 Componentes del kit

Nota: 1) El tampón 5× contiene dNTP. 2) La mezcla enzimática EntiLink™ contiene inhibidor de ARNasa.

Componente Cantidad

DDH₂O sin ARNasa 2×1 mL

Tampón 5× 400 μL

Mezcla enzimática EntiLink™ 200 μL

Oligo(dT)18 (50 μM) 100 μL

Cebadores aleatorios N6 (50 μM) 100 μL

Manual del usuario (1 copia)

 Ventajas

1. Sintetiza eficientemente ADNc de primera cadena de longitud completa de hasta 10 kb. 2. Soporta temperaturas de reacción de hasta 50 °C. 3. Incluye todos los componentes necesarios para la reacción de RT. Aplicación del kit

1. Construcción de la biblioteca de ADNc.

2. Reacción RT-qPCR y reacción RT-PCR. 3. Extensión del cebador.

3. Secuenciación del ARN.

Notas

1. Todas las operaciones deben realizarse en hielo y debe evitarse la contaminación por ARNasa.

2. Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables.

3. ¡Este producto es solo para uso en investigación!

Reactivos y artículos autoabastecidos

1. Tubo de microcentrífuga de 200 μL sin ARNasa. 2. Pipetas y puntas (para evitar la contaminación por ARNasa, se deben utilizar puntas de pipeta sin ARNasa con cartuchos de filtro). 3. Guantes, mascarillas y otros equipos de protección desechables. 4. Baño de agua a temperatura constante. 5. En operaciones de laboratorio libres de ARNasa: Debido a la ARNasa presente en la saliva y la piel, utilice guantes de látex y una mascarilla durante todo el proceso de extracción de ARN.

Pasos de la operación

1. Preparación del sistema de reacción de transcripción inversa (sistema de 20 μL)

Componentes Volumen

ARN total 1 ng - 5 μg* o ARNm 1 ng - 500 ng* Tampón 5× 4 μL

Cebadores aleatorios N6 (50 μM) 1 μL

u Oligo (dT)18 (50 μM) o 1 μL

o Cebadores específicos de genes (2 μM) o 1 μL

Mezcla de enzimas EntiLink™ 2 μL

H₂O sin ARNasa hasta 20 μL

[Nota]: *Si el experimento posterior es qPCR, se recomienda que la cantidad de ARN total o ARNm de entrada no supere 1 μg o 100 ng, y si la abundancia de expresión del gen diana es muy baja, hasta 5 μg de ARN total o Se pueden introducir 500 ng de ARNm. ** Si el experimento posterior es PCR, para plantillas complejas, el ARN, el H₂O y los cebadores de transcripción inversa se pueden incubar a 65 °C durante 5 min y luego enfriar rápidamente en hielo antes de añadir la mezcla enzimática EntiLink™. Si el experimento posterior es qPCR, se puede omitir la incubación a 65 °C y añadir la mezcla enzimática EntiLink™ directamente al sistema. 2. Programa de reacción

Temperatura de reacción

Tiempo de reacción

25 °C 5 min

42 °C 30 min

85 °C 5 min

[Nota]: 1) Los experimentos de cuantificación de fluorescencia se pueden realizar utilizando únicamente cebadores aleatorios N6; también se pueden mezclar 1:1 con oligo (dT)18 para obtener mejores resultados. 2) Temperatura de transcripción inversa: se recomienda 42 °C. Para plantillas con alto contenido de GC o plantillas complejas, la temperatura de transcripción inversa puede aumentarse a 50 °C. 3) Los productos de transcripción inversa pueden almacenarse a -20 °C durante un corto período de tiempo. Si se requiere un almacenamiento prolongado, se recomienda almacenarlos a -80 °C después de dispensarlos para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.

3. Selección del cebador

1) Si la plantilla es de origen eucariota, se recomienda elegir Oligo (dT)18, que se empareja con la cola poli A 3' del ARNm eucariota para obtener el máximo rendimiento de ADNc de longitud completa. 2) Para la transcripción inversa de ARN procariota, utilice cebadores aleatorios N6 o cebadores específicos para genes. 3) El cebador aleatorio N6 es ampliamente aplicable. Las plantillas de ARNm, ARNr, ARNt, ARN pequeño y ARNncLn pueden transcribirse de forma inversa con el cebador aleatorio N6. 4) Para la síntesis de ADNc de menos de 2 kb, utilice 1-2 μL de cebadores aleatorios N6; para la síntesis de ADNc de más de 2 kb, utilice 0,4-1 μL de cebadores aleatorios N6

Introducción

El inhibidor de RNasa es un inhibidor de RNasa recombinante expresado en forma soluble en Escherichia coli. Tiene el mismo efecto de aplicación que un inhibidor específico de ribonucleasa presente en la placenta humana. Su esencia es una proteína con un peso molecular de 51.000 Da, etc. El pH del punto eléctrico es de 4,7. El inhibidor de RNasa puede unirse específicamente a las RNasas A, B y C mediante un enlace no covalente para formar un complejo 1:1 que inactiva la RNasa, y posee un amplio espectro de actividad inhibidora de RNasa. La RNasa es activa en tampones de 0-0,5 MNaCl, pH 5-8, y alcanza su máxima actividad a pH 7,8. La RNasa protege la integridad del ARNm y mejora la eficiencia de la transcripción y la traducción, a la vez que evita los posibles efectos del uso de inhibidores de compuestos orgánicos. El inhibidor de RNasa es compatible con diversas transcriptasas inversas y la ADN polimerasa mediante RT-PCR y RT-qPCR. En comparación con el inhibidor de ARNasa humano, el inhibidor de ARNasa recombinante no contiene dos cisteínas y, por lo tanto, tiene una mayor actividad antioxidante y es más adecuado para experimentos sensibles a DTT alto (como qPCR).

Aplicación

Síntesis de ADNc de primera cadena, aislamiento de polisomas, traducción in vitro, transcripción in vitro en sistemas sin células, transcripción in vitro de la ARN polimerasa SP6 o T7. Solución de almacenamiento: HEPES-KOH 20 mM (pH 7.5), KCl 50 mM, DTT 5 mM, glicerol al 50 %.

Unidad activa:

La cantidad de enzima necesaria para inhibir el 50 % de 5 ng de actividad de la ARNasa A se define como 1 unidad de actividad (U). (La actividad de inhibición se determina mediante la inhibición de la hidrólisis de la ARNasa A por el 2', 3'-CMP cíclico).

Pureza:

1. Se hicieron reaccionar 300 unidades de inhibidor de la ARNasa y 1 μg de ADN pBR322 superenrollado a 37 °C durante 1 hora, y las bandas de electroforesis del ADN no se modificaron. Se hicieron reaccionar 2.100 unidades de inhibidor de la ARNasa y 1 μg de ARNr 16S, 23S a 37 °C durante 1 hora, y las bandas de electroforesis del ARN no se modificaron. 3. SDS-PAGE: una sola banda con un peso molecular de 50 kDa.

Dosis recomendada:

1. Reacción de síntesis de ADNc (inhibidor de la ARNasa, volumen de reacción: 0.5 unidades/μl).

2. Traducción in vitro (inhibidor de la ARNasa, volumen de reacción: 1 unidad/μl).

3. Transcripción in vitro en sistema acelular (inhibidor de la ARNasa, volumen de reacción: 20 unidades/μl).

4. Transcripción in vitro de la ARN polimerasa SP6 o T7 (inhibidor de la ARNasa, volumen de reacción: 1 unidad/μl).

5. Inhibidor de polisomas (cantidad de reacción: 1 unidad/μl).

Atención

La actividad inhibidora tiene un amplio rango de pH y alcanza su máxima actividad a pH 7.0-8.0.

La formación de espuma o la agitación intensa (vórtice, etc.) pueden provocar la desactivación.

Ventajas

1) Obtención rápida de resultados, ahorrando hasta un 50% de tiempo

2) Mezcla maestra optimizada y lista para usar para reacciones PCR rápidas

3) Detección precisa de diversas cantidades iniciales de moldes, amplificación estable, resultados cuantitativos con alta repetibilidad

4) Relaciones iónicas equilibradas de K+ y NH4+, así como un encapsulado independiente del colorante de referencia ROX para todos los instrumentos de PCR en tiempo real

Introducción

EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix es una mezcla maestra optimizada para PCR en tiempo real 2x que contiene ADN polimerasa HotStarTaq, colorante fluorescente SYBR Green®, dNTP y Mg2+. Además, las relaciones iónicas equilibradas de K+ y NH4+ en el tampón promueven la hibridación específica de cebadores. Para garantizar una reacción de PCR altamente sensible y específica, la reacción se puede iniciar simplemente añadiendo el cebador y el molde de ADNc a la mezcla maestra de PCR lista para usar. El exclusivo tampón de PCR garantiza una qPCR sensible en todos los instrumentos de PCR en tiempo real sin necesidad de optimización.

Principio del kit

EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix ofrece una amplia gama de ensayos específicos y sensibles para máquinas de PCR estándar y rápida. El colorante SYBR Green I de la mezcla maestra permite analizar múltiples ácidos nucleicos diana sin necesidad de sintetizar sondas específicas de secuencia. El tampón especial de PCR rápida reduce considerablemente el tiempo de desnaturalización, hibridación y extensión, y es muy adecuado para moldes complejos, moldes con más residuos de inhibidores de PCR (como ADN de suelo y fecal) y para la amplificación de largo alcance. Además, la ADN polimerasa HotStarTaq se puede activar mediante calentamiento a 95 °C durante 30 segundos, lo que requiere un arranque en caliente estricto para evitar la formación de productos inespecíficos.

Aplicación del kit

EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix se puede utilizar para el análisis de la expresión génica de ADNc, plásmidos, ADNg y análisis cuantitativo absoluto. Es compatible con diversos equipos de PCR en tiempo real, como ABI, Bio-Rad, Eppendorf, Roche y Agilent. Atención:

1. Plantilla

ADNc: Para la qPCR cuantitativa en dos pasos, utilice 10 μL de ADNc retrotranscrito a partir del ARN total (10 pg a 1 ng).

En el sistema de reacción de 20 μL, la cantidad de plantilla de ADNc utilizada no suele superar los 100 ng. Cabe destacar que, al detectar genes de alta abundancia en ADNc sin diluir, el valor Ct en los resultados de la PCR cuantitativa puede ser demasiado bajo, lo que puede afectar la precisión de la cuantificación. La dilución en gradiente de la plantilla de ADNc proporciona resultados más precisos. ADN plasmídico y genómico: Se pueden utilizar de 100 pg a 1 ng de ADN genómico o de 10 a 107 copias de ADN plasmídico en un sistema de 20 μL.

2. Transporte y almacenamiento

1) Bolsa de hielo, transporte en hielo seco. 2) Conservar a -20 °C en un lugar oscuro. Este producto contiene el colorante fluorescente SYBR®Green I. Al almacenar o formular el sistema de reacción, evite la luz intensa. Agítelo boca abajo antes de usarlo. 3) Para su seguridad y salud, utilice bata de laboratorio y guantes desechables al realizar el experimento.